メニューにジャンプコンテンツにジャンプ

トップページ > 研究部紹介 > 共通実験室 > 電顕・標本作成支援

電顕・標本作成支援

共通実験室では、専門の支援員による透過型電子顕微鏡の試料作成支援・組織切片作成支援を行い、センター内の研究者の皆様の連携研究をサポートしています。どうぞお気軽にご相談ください。
ご依頼の際には、下記の支援業務依頼書をご提出ください。

受益者負担金について

各種研究支援・機器利用に掛かる消耗品費を受益者負担として、下記のようにご負担頂きます。
注:受益者負担金は、各研究部単位で研究所経費から庁費振替いたします。
6月・10月・2月末締めで処理いたします(3月分は翌年度に持ち越しになります)。

試料作成支援(ランニングコスト)

透過型電子顕微鏡(日本電子 JEM-1400)試料作成支援

  • 超薄切片作成(固定液準備・樹脂包埋・切片作成・グリッド・電子染色) 単価:5,000円/検体
  • ネガティブ染色(固定液準備・グリッド・電子染色) 単価:2,000円/検体
  • 免疫電顕(固定液準備・樹脂包埋・切片作成・グリッド) 単価:5,000円/検体

走査型電子顕微鏡(日本電子 JSM-IT300)試料作製支援 NEW!

  • 試料作成(固定液準備・脱水・凍結乾燥・金属蒸着・試料載台) 単価:2,000円/検体

組織切片作成支援(パラフィン切片/凍結切片共通)

  • ブロック作成 単価:1,000円/ブロック
  • HE・PAS-alcianblue・EV・MT・オイルレッドO染色 単価:100円/スライドグラス
  • 免染用 未染色切片(剥離防止コートグラス) 単価:50円/スライドグラス

注:プレパラートケースは、ご必要な場合にのみお付けします。 (100枚入り@1000円・25枚入り@500円)

注:走査型電子顕微鏡(SEM)試料作成支援につきましては、日本電子株式会社様(JEOL)の委託分析をご紹介しております。日本電子専門スタッフによる検体調製や、最新鋭の機器を用いたSEM立会観察・撮影ができます。
支援員が窓口となり、固定から脱水のプロセスをサポート致します。ご気軽にご相談ください。

機器利用(ランニングコスト) 注:2015年7月1日ご利用分から NEW!

  • フローサイトメーター(シース液・クリーニング液・精度管理用ビーズ) 単価:1,000円/回
  • レーザーマイクロダイセクション
    (注:専用メンブレンスライドグラス・回収用チューブをご使用の場合のみ)
    単価:2,000円/スライドグラス

支援実績データの収集にご協力ください

共通実験室では、皆様のご利用実績に基づいて 今後の支援のあり方やご利用料金の見直し、共通利用機器類の導入要望等を検討して参ります。

当室の研究支援が学会発表・論文などの研究実績に貢献いたしましたら、(i)電顕支援の場合には支援員を共著者として頂き、(ii)組織標本作成支援の場合には謝辞に共通実験室をご利用頂いた旨を明記してください。

また、 「学会名(大会開催日時)」・「論文名(雑誌名・発行日・ページ)」の情報を 支援員までお寄せください。

今後の支援体制の向上のために、是非とも皆様のご理解・ご協力を宜しくお願い申し上げます。

透過型電顕用試料作成フロー

透過型電顕用試料作成フロー

サンプルの固定

ご観察希望の試料それぞれについて、固定液の組成や固定方法を選択する必要があります。お打ち合わせ時に最適なプロトコールをご提案いたします。まずはお気軽にご相談ください。
固定液は、サンプリング直前に支援員が用事調整し、依頼者にお渡しいたします。
試料に対してたっぷりの固定液の中で、ゆっくりと撹拌しながら固定液を浸透させます。
固定が完了しましたら、洗浄液でよく洗い、支援員にお引き渡しください。
注:固定液は経時的に劣化してしまいます。固定直前にお渡しできるようにスケジュールをお打ち合わせください。
注:固定廃液と洗浄1回目の廃液は、当方でまとめて廃液処理業者に託しますので、支援員にお渡しください。

電子染色 脱水 包埋

電子染色 脱水 包埋固定、洗浄が終わった試料は、支援員にお引き渡し頂いた後、脱水・樹脂包埋いたします。
培養細胞などの場合には、樹脂包埋の前に電子染色を行います。
樹脂包埋よりも前の工程で電子染色するこの方法は「ブロック染色 (en bloc staining)」と呼ばれており、切片の電子染色工程よりも簡便で、且つ切片を汚染・損傷するリスクを避けるというメリットがあります。

電子染色の後は50%EtOHで洗浄し、引き続きEtOHシリーズで脱水します(70%→90%→100%×3回)。
必要に応じて酸化プロピレン(PO)で置換した後、1昼夜かけて樹脂に置換します。
樹脂が十分に浸透した試料は、エポキシ樹脂の場合は60℃で48時間、水溶性樹脂の場合は4℃にて1週間程度UV照射して樹脂重合させます。このとき、試料の形状や方向性(オリエンテーション)を考慮しながら、包埋方法をデザインします。
電顕観察支援試料によっては、専用のカプセル内に包埋する場合と、ディッシュなどに培養したまま平板包埋する場合があります。
平板包埋の場合は、必要な部位を糸鋸で切り出して支持台に固定し、剃刀で切削面をトリミングしてから ウルトラミクロトームで超薄切片を作成します。
70から100ナノメートル厚に切った超薄切片は、プラスチック支持膜を張った直径3ミリメートルのグリッドに載せます。予めブロック染色を施していない試料の場合は、グリッドに載せた切片を電子染色します。これで検鏡準備完了です。

電顕観察支援

超薄切片の観察準備が整いましたら、支援員がプレ観察し、ご依頼者に大まかな像をお届けいたします。
ご都合の良い時に、実際の電顕像をご自身で是非御覧ください。
電顕観察支援は、平日午前10時から午後5時の間で随時対応いたします。お気軽にご相談ください。

酢酸ウラニル使用の手引き

電顕試料作成に欠かせない電子染色には、酢酸ウラニルを用います。ウラン化合物は、国際規制物質の一つに指定されており、使用に当たっては厳密な管理の元行われることが義務付けられています。当センターでは、依頼者から試料作成支援として引き渡された試料は、管理委員・支援者が適切な方法でウラン電子染色した後に依頼者にお引き渡しいたしますので、基本的には依頼者ご本人がウラン化合物に触れることはありません。
ここに挙げる「酢酸ウラニル使用の手引き」は、電顕試料を自ら作成される方のために、当研究所が定めたガイドラインです。
(注:本ガイドラインの内容については、必要に応じ随時修正・更新することがあります)

酢酸ウラニル使用のガイドラインについて

酢酸ウラニルは「国際規制物資」の1つ、核燃料物質です。使用にあたっては国際規制物資の届出及び計量管理が必要であり、法律によって厳しい管理が義務付けられています。国際医療研究センター研究所は、この酢酸ウラニルの使用許可を受けた研究施設(MBA)に指定されています。
酢酸ウラニルの管理については、研究所長を管理責任者とし、核燃料物質計量管理委員会が設置されています。酢酸ウラニル(粉末)は、文科省に申請済みの保管場所に管理委員が施錠保管し、半年ごとに計量管理記録を提出することが義務付けられています。本研究所では、計量管理記録を一元化するために、管理委員が酢酸ウラニル溶液を作成し、研究者の皆様に随時分与致します。
廃液は、流し等に捨てることができません。最終廃棄処理の方法が法的に整備されていない現在、原則として施設内に保管廃棄(永久保存)です。廃液は下記の「3:廃液の取り扱いについて」に準じ、管理委員にお引き渡しください。
ご利用の皆様・周辺への安全を十分に確保するために、下記のガイドラインを熟知のうえ、研究を行ってください。

保管・計量管理について

保管・希釈用分与、および研究所外部への持ち出し・外部からの受け入れにあたっては、研究所長を管理責任者とし、核燃料物質計量管理委員会を一元的な窓口と定めます。計量管理責任者は、計量管理規程に基づき増減管理を行い、毎年6月末・12月末に文科省に計量管理記録報告書を提出する。
酢酸ウラニル(粉末)・廃液等は、鉛シートに包んだ容器に入れ、転倒・漏出しないように配慮して鍵付きキャビネットに保管する。キャビネットは管理委員が施錠する。

酢酸ウラニル溶液作成依頼・使用について

酢酸ウラニル溶液は、管理委員が作成したものを各研究者に分与する。使用にあたっては、管理委員に申請し、管理委員立ち会いのもと手渡しで受け取る。
ウラン溶液の使用は各実験室で行えるものとするが、下記の注意事項を遵守する。

  • 溶液の使用はフード内または換気のある部屋で行う。
  • 実験机は汚染の広がらないような準備を講じて行う(給水マット等)。
  • 溶液取り扱い場所では飲食禁止。

注:切片作成支援を依頼される場合は、酢酸ウラニル・クエン酸鉛で電子染色済みの試料(グリッド)をお渡しいたしますので、基本的にはご依頼者がご自身でこれらの化合物に触れることはありません。
ご自身で切片を作成される場合のみ、お好みの濃度で調整してご用意いたします。どうぞご相談ください。

廃液の取り扱いについて

各実験室で発生したウラン廃液は、法令等が定められるまで下記の方法で研究所内に廃棄保管する。

  • 少量の廃液は、ろ紙などに吸い込ませ、アルミホイル等の上に置いてドラフト内で乾燥させ、管理委員に託す。
  • ろ紙に吸い込ませるのが困難な量の場合は、廃液入れに取り置いて管理委員に託す。

パラフィン組織切片作成フロー

パラフィン組織切片作成フロー

パラフィン組織切片用の固定について

パラフィン組織切片用の固定について組織切片用の固定には、一般的には10から20%の中性緩衝ホルマリン、4%パラホルムアルデヒドなどのアルデヒド系固定液を用います。
臓器によっては、浸透性の高いピクリン酸を用いたブアン(Bouin)固定が有効な場合もあります。

浸漬固定の場合には、組織への固定液の浸透を良くする工夫が非常に重要です。固定不足は、臓器の内部の組織が崩れたり、染色性の低下を招きます。
固定液の浸透に要する時間は「1ミリメートル/時間」程度といわれています。解析に差し支えない程度にメスで割を入れたり、数ミリメートル厚程度にスライスしていただきますと、良好な固定結果が得られます。
摘出した臓器を適切な大きさに裁断し、鉛筆でラベルしたヒストカセットにセットし、ビーカーなどに入れたたっぷりの固定液の中で、撹拌しながら固定液を浸透させます。
ヒストカセットはお分けいたしますので、ご遠慮なくお申し出ください。

アルデヒド固定後は、アルデヒド分を除去するために、少なくとも3時間程度流水(またはPBS)で洗浄してください。
その後、70%エタノールに浸漬した状態で サンプルをお引き受けいたします。
ピクリン酸固定の場合は、70%エタノールで色抜きしてください。